乙醯化Snail促進腫瘤細胞激素分泌並吸引巨噬細胞聚積

內科部血液科主任 楊慕華

前言：

　　上皮細胞中胚層轉化(epithelial-mesenchyaml transition；EMT)是指在胚胎發育時上皮細胞失去其極性轉變成具有活動能力的中胚層細胞的一個過程，近年來許多研究發現EMT是腫瘤晚期惡化與轉移的關鍵步驟。EMT是由Snail，Slug，Twist1等轉錄因子藉由抑制E-cadherin所引發，然而單純的抑制細胞間接合蛋白並不足以解釋複雜的轉移過程，且EMT細胞與宿主細胞間的交互作用，至今仍未明。Snail是一個鋅指蛋白，已被發現和各類腫瘤之侵襲性與轉移有關。過去研究認為Snail為一轉錄抑制因子：Snail藉由吸引不同之轉錄抑制蛋白抑制下游基因之轉錄，這方面的研究報告已經很清楚，但是Snail做為轉錄活化蛋白，目前所知非常有限。

研究內容：                                   

一、Snail引發下游基因轉錄活化之分子機制。

　　Snail做為轉錄活化蛋白腳色時常見的調控基因有ERCC1和IL8，藉由直接結合在ERCC1以及IL8啟動子上導致轉錄活化。我們用染色質免疫沉澱技術(Chromatin immuneprecipitation；ChIP)實驗方法觀察到Snail扮演活化因子時會促進組織蛋白乙醯化(histone acetylation)，這與Snail扮演抑制因子時會促使組織蛋白甲基化(histone methylation)有所不同。進一步去釐清各種組織蛋白乙醯轉移酶對Snail的影響後，發現是其中的CREB-binding protein (CBP)/p300會使Snail乙醯化並且與Snail結合成為輔激活因子(coactivator)一起去調控啟動子。質譜儀(Mass spectrometry)分析結果顯示CBP/p300是在Snail蛋白質上的第146位置和第187位置的離胺酸執行乙醯化。有文獻指出在TNFa的刺激環境下，CBP會被IKKa激酶(IkB kinase a)磷酸化並增加其乙醯轉移酶的活性。我們細胞實驗結果證實CBP有無磷酸化的確會影響Snail乙醯化，TNFa的刺激也會增加Snail去調控ERCC1和IL8啟動子的能力，若把Snail做點突變讓146和187兩個位置的胺基酸無法被乙醯化，則會看到原本增加的趨勢被抑制下來。接下來我們探討乙醯化之Snail有何獨特功能。我們分析Snail大量表現的細胞株和Snail點突變(Snail2R)表現的細胞株之DNA微陣列數據，可以比較出乙醯化Snail活化之下游基因多半與免疫反應有關，甚至乙醯化Snail會透過跟一些細胞激素的啟動子上E-box序列結合來增加基因表現，這些細胞激素包括TNFa，CCL2，CCL5。Snail活化產生的TNFa又能夠再去影響TNFa-IKKa-CBP這個訊號傳遞路徑，形成了一種正向回饋。

二、乙醯化Snail的癌細胞對宿主免疫細胞之影響

　　以上的實驗結果顯示乙醯化Snail會促進癌細胞CCL2、CCL5的分泌，而這兩種細胞激素已有文獻報告會增加腫瘤相關巨噬細胞(tumor-associated macrophages; TAM)的聚集，因此我們想探討大量表現Snail的癌細胞是否會吸引TAM聚集，以及Snail有沒有乙醯化是否扮演關鍵腳色。我們利用細胞遷移實驗發現Snail過度表現之頭頸癌細胞株釋放出的細胞激素明顯吸引比較多單核細胞移行，但是表現Snail無法乙醯化之頭頸癌細胞吸引單核細胞移行的數量就降至跟控制組別一樣少。我們也在動物實驗上驗證上述觀察：把3種不同組別的頭頸癌細胞(FaDu-control、FaDu-Snail、FaDu-Snail2R)分別透過尾靜脈打入免疫缺陷小鼠，6小時後一樣透過尾靜脈再打入人類CD14陽性單核細胞，然後30小時之後將所有小鼠犧牲並取其肺臟。因為打入的人類CD14陽性單核細胞事前有使用紅色螢光染劑標記在細胞表面，所以取出的小鼠肺臟用膠原蛋白酶I分解組織後便可以用流式細胞分析儀來偵測和計算小鼠肺臟中有多少人類CD14陽性單核細胞受到第一次打入的頭頸癌細胞吸引而聚積在肺臟。實驗結果發現相較於FaDu-Snail2R和控制組，FaDu-Snail組別小鼠肺臟聚集2.5倍多的人類單核細胞數目。另外我們使用小鼠乳腺癌細胞4T1來建立4T1-control、4T1-Snail、4T1- Snail2R穩定過度表現的三種細胞株，分別植入免疫缺陷小鼠的乳腺裡，一個月後測量4T1三種細胞株在乳腺所形成的腫瘤大小與重量，結果顯示過度表現Snail的腫瘤比較大也比較重，腫瘤還都轉移到肺臟，而Snail不能乙醯化的組別則受到抑制。在免疫組織染色的4T1腫瘤切片觀察到Snail大量表現的癌細胞會吸引許多TAMs滲入腫瘤之中，周圍微血管新生的數目也有增加，若把Snail乙醯化能力去除則吸引TAMs滲入數目和微血管新生數目均下降至跟控制組差不多。我們進一步使用TNFa基因剔除小鼠，去除小鼠本體分泌的TNFa的能力來看植入小鼠的癌細胞分泌之TNFa會對腫瘤的生長有何影響。發現Snail過度表現之癌細胞株，腫瘤形成與轉移能力仍然比較強，吸引巨噬細胞至腫瘤處堆積和促進微血管新生能力明顯比控制組高，但是把Snail過度表現之癌細胞株再用RNA干擾(RNAinterference)方法把TNFa基因專一性的停止表現，則會發現原本Snail誘導巨噬細胞至腫瘤處堆積和促進微血管新生能力均會受到抑制，甚至細胞移行能力和所形成的腫瘤大小也下降至跟控制組差不多。這些實驗結果再次說明Snail的乙醯化對於腫瘤轉移和影響周圍微環境能力是很重要的，而腫瘤本身所分泌的TNFa則是造成惡性循環及加速腫瘤惡化的元凶。臨床方面，在82個頭頸癌病人的檢體切片中我們加以驗證以上所發現的機制，腫瘤表現較多乙醯化Snail的病人通常也伴隨較多量的TAM聚集，而此類病人存活率也比其他病人來得差。

結論：

　　我們發現頭頸癌惡化過程中，癌細胞透過TNFa誘發Snail乙醯化來促進腫瘤分泌各種細胞激素，而這些細胞激素會誘使宿主巨噬細胞聚集至腫瘤處並改造這些免疫細胞成為癌症的幫兇，加速腫瘤的惡化及轉移。這個腫瘤微環境重塑之關鍵訊息，未來若能針對此訊息做為阻斷標的，將對晚期癌症治療產生重要影響。