毛囊外巨環境在老化所導致毛髮再生不良中所扮演的角色

皮膚部主治醫師 陳志強

　　頭髮在人類社交生活中扮演一個很重要的角色，因為禿頭會使人缺乏自信並顯得蒼老。禿頭的情形會隨著年齡的增長而惡化，其中一個主要的原因為毛囊幹細胞的老化導致再生不良所引起，老化是組織修復和再生的能力進行性惡化的一種生理過程。由於毛囊是我們器官中少數能終其一生不斷的進行退化與再生的組織，因此它是研究幹細胞再生及老化的一個最佳範例，毛囊的再生循環過程主要可分為連續的4個階段：生長期(anagen)、退化期(catagen)，休止期(telogen)，和脫落期(exogen) (Paus and Foitzik, 2004)。而在這個循環過程的背後其實也說明了毛囊幹細胞能夠短暫的跳脫其休眠(quiescent)的狀態進行不對稱分裂而產生快速增生的先驅細胞 (transient amplifying progenitor cell)，並維持其幹細胞數量的恆定，而這樣的幹細胞活化的循環過程牽涉到毛囊內微環境(microenvironment)的週期性 Wnt/b-catenin的活性變化 (Huelsken et al., 2001; Reddy et al., 2001; Lo et al, 2004; Lowry et al., 2005)。
　　一般相信niche的microenvironment對許多系統中幹細胞衡定的維持扮演非常重要的角色 (Moore et al., 2006; Tiede et al., 2007) 。以毛髮的幹細胞為例，以往大家都認為毛髮幹細胞是受到毛囊內微環境也就是真皮乳頭 (dermal papilla)的調控而產生周而復始的再生循環。然而近年來Maksim V. Plikus等人發現成年小鼠毛髮的再生與脫落是呈現規律的循環如波浪的型態 (Plikus and Chuong., 2008)，而這也暗示著毛囊幹細胞與幹細胞週遭環境的交互作用與訊號的傳遞將對毛髮的生長產生決定性的影響。我們都知道在胚胎發育初期時，毛髮的分化與生長主要是透過Wnt/b-catenin及bone morphogenic protein (BMP)的訊號傳遞及調控而達成的。BMP隸屬於tranforming growth factor beta (TGF-b) 的大家族中，而且它在胚胎發育尤其是型態及骨骼形成的發展上扮演一個很重要的角色。近年由美國南加州大學鍾正明院士所帶領的研究團隊發現，真皮層BMP 2/4信號的周期性表現是調控毛髮幹細胞週期性再生的重要關鍵因素(Plikus et al., 2008)。他們也發現真皮層BMP 2/4信號的周期循環是跳脫在表皮層Wnt/b-catenin的訊號循環之外形成交錯的情形，而這兩個循環的交錯表現使得我們可以將傳統的毛髮休止期 (telogen) 分成兩個功能性分期：那就是絕對不反應休止期 (refractory telogen) 和可反應休止期 (competent telogen)。這兩個時期的分別主要是取決於真皮層BMP訊號表現的高低，在不反應期時有較高的BMP訊號表現；反之在有能力再生期時則BMP訊號表現降低。此外，過度表現BMP的拮抗訊號，即noggin在老鼠的皮膚上時則可以縮短毛髮的不反應期使得毛髮加快進入下一個再生波動的循環。而若是將這種過度表現noggin的突變小鼠的皮膚移植到正常小鼠的背上時，移植者 (donor) 及被移植者 (host) 將會互相影響其毛髮再生的循環，而其結果則取決於真皮層中BMP訊號表現的高低，而額外給予BMP的蛋白質將使competent telogen轉變成refractory telogen。從上述的研究成果可以得知，毛囊幹細胞恆定 (homeostasis) 是一種階級性的調節 (hierarchical regulation) 並透過毛囊之間的巨環境 (inter-organ macro-environment) 調控而達成。

　　單一毛囊會週而復始的自行進行再生和退化週期，然而實際情形上毛囊的再生及活化並不只是單單取決於自身幹細胞的再生能力而是會受到週遭毛囊及環境的影響 (Suzuki et al., 2003)，當週遭環境處於可反應休止期 (competent telogen) 時，毛髮再生的活化因子將如浪潮 (wave) 一樣傳遞給週遭的毛囊，並使得這些毛囊依序被活化起來 (從生長期第一期 (anagen I) 到第六期 (anagen IV))，此現象稱為“傳遞浪潮”(propagating wave) (Plikus et al., 2009)。當某處的毛囊被活化時，若是其週遭環境的BMP表現量低 (環境處於可反應休止期 (competent telogen)) 時，其週遭的毛髮將會被此傳遞浪潮給活化而再生；反之，若是其週遭環境的BMP表現量高(環境處於絕對不反應休止期 (refractory telogen))時，此傳遞浪潮將無法將活化因子傳遞給週遭之毛囊，使這些毛囊會持續處在休止期的狀態。所以藉由毛髮再生波動循環的觀察，將有助於了解毛囊幹細胞再生循環的分子機轉。

　　組織老化的特徵在於減少再生和維持恆定的能力。先前的研究推測幹細胞的減損在老化相關的功能衰退中扮演了關鍵的角色(Jones and Rando, 2011; Liu and Rando, 2011; Nishimura et al., 2005)。然而，卻也有不同的研究顯示幹細胞在組織中的數目並不一定顯著隨年齡增長而減少(Booth and Potten, 2000; Brack and Rando, 2007; Giangreco et al., 2008)。因此，老化所導致的再生能力減損或喪失有可能是肇因於毛囊幹細胞本身的異常，毛囊內微環境及毛囊外巨環境的改變，或是三者兼而有之。為了要解開這個謎團，我們便開始觀察老年小鼠其毛髮再生的情形。結果發現在老化發生的過程中毛髮再生循環的波動情形將會變的複雜且異常，且兩歲大的小鼠其毛髮休止期的時間也遠長於年輕小鼠，此外年老小鼠其毛髮波浪傳遞的速度也遠低於年輕小鼠。我們認為有五種可能的原因來解釋老化對毛髮再生異常的影響：(1) 毛髮誘導信號，如Wnt訊號途徑蛋白質因老化而減損，(2) 來自相鄰生長期毛囊或毛囊外巨環境所分泌傳遞信號或活化因子因老化而降低，(3) 年老的毛囊幹細胞不能對傳遞信號產生反應，(4) 毛髮幹細胞的數量及功能因年老而減損，(5) Wnt信號的抑制因子，如DKK和SFRP或BMP，在老年小鼠中被過度活化而抑制毛髮進入生長期和毛髮波浪的傳遞。

　　藉由RNA的in situ hybridization (原位雜交)的實驗我們發現Wnt訊號途徑蛋白質的表達強度並不會因為年老而有所改變，此外利用毛髮幹細胞表面抗原標記物進行FACS分析也發現，CD34 及 CD49f 陽性的細胞 (即代表毛囊幹細胞) 其數量在年輕與年老的小鼠中是相當的。而免疫化學染色的結果也顯示毛囊幹細胞的表現蛋白如K6、CD34和Krt15其表現量在年輕及年老小鼠中也是相似的。上述的這些結果暗示著毛囊幹細胞數目與功能並不會隨著年齡而耗損，而毛囊外環境的改變似乎是導致毛髮再生異常的原因。為了要證實這個假說我們便將休止期延長的老年小鼠之背部皮膚移植至年輕SCID小鼠之背上，並觀察其毛髮再生的情形。結果顯示當我們移植較小塊的皮膚時 (大約5×3mm)，老化導致休止期延長的情形可以被拯救而回復成年輕的狀態。然而若是移植大片的皮膚時(大約15×10mm)，則只有周邊的毛囊可以被回復。這個實驗證明了毛囊周邊之巨環境對於調控毛囊幹細胞活化與否扮演著重要的角色，而年老小鼠其毛囊幹細胞仍有再生的能力，只是年老的毛囊外巨環境無法給予適當的訊號來誘發其再生。

　　接下來我們便想找出究竟是環境中的那些因子會導致老年小鼠的毛髮再生異常，由於我們之前的研究顯示毛囊外的訊號包括BMP和Wnt信號的抑制因子如DKK和SFRP都可以調控毛囊幹細胞的活化與再生 (Plikus et al., 2011)，因此我們便先從這些因子來著手。原位雜交的結果顯示在毛囊外真皮組織中的BMP-2、DKK-1和SFRP-4的表現量在年老小鼠的各個毛髮再生周期中均遠高於年輕小鼠，而RT-PCR的結果也證實了這個結果，由此可知毛囊外巨環境中抑制因子的過度表達似乎是造成年老小鼠毛髮幹細胞再生異常的主因。

　　除了抑制因子之外，我們認為毛囊外的巨環境中應該也存在著活化因子來活化毛囊幹細胞並協助毛髮波浪的傳遞。在利用原位雜交的方法篩選了很多分子之後發現follistatin，一種BMP的抑制因子其表達的時期恰巧相反於BMP-2、DKK-1和SFRP-4。而且若是將follistatin的合成蛋白質打到小鼠的背部皮膚可以誘發毛髮的再生並促進毛髮波浪的傳遞，由此可知毛囊外真皮組織所分泌的follistatin是一種促進毛髮再生的活化因子。接下來我們想知道follistatin在老年小鼠的表達情形，結果顯示follistatin在老年小鼠毛囊外真皮層中的表達遠低於年輕小鼠，由此可知活化因子的降低也是導致老年小鼠毛髮再生不良的原因之一。

　　我們的研究顯示毛囊外的巨環境會有抑制因子 (包括BMP-2、DKK-1及 SFRP-4) 和活化因子如follistatin 的循環表現，而此交替循環的表現將可調控毛囊幹細胞使其維持恆定。而我們的結果也顯示，當老化的現象發生時這些巨環境中的抑制因子將會過度表達，而活化因子的表現則會降低 (Chen et al., 2014)。這些結果暗示著我們，毛囊外的巨環境必定存在著更多的循環表現的調控因子來調節幹細胞的再生循環及老化現象。毛囊幹細胞會接受來自毛囊內及毛囊外的各種活化及抑制因子的調控以決定應該要活化或維持休眠狀態。由於幹細胞的取得以及直接對幹細胞作調控是較難以達到的方式，因此若是我們能針對毛囊外環境而非幹細胞本身來做調控將可為未來抗老化及退化性疾病的治療帶來一線新的曙光。

參考文獻

• Booth C, Potten CS. Gut instincts: thoughts on intestinal epithelial stem cells. J Clin Invest 2000;105:1493-9.
• Brack AS, Rando TA. Intrinsic changes and extrinsic influences of myogenic stem cell function during aging. Stem Cell Rev 2007;3:226-37.
• Chen CC, Murray PJ, Jiang TX, et al., Regenerative hair waves in aging mice and extra-follicular modulators follistatin, dkk1, and sfrp4. J Invest Dermatol. 2014;134(8):2086-96. 
• Giangreco A, Qin M, Pintar JE, et al. Epidermal stem cells are retained in vivo throughout skin aging. Aging Cell 2008;7:250-9.
• Huelsken J, Vogel R, Erdmann B, et al. b-Catenin controls hair follicle morphogenesis and stem cell differentiation in the skin. Cell 2001;105:533-545.
• Jones DL, Rando TA. Emerging models and paradigms for stem cell ageing. Nat Cell Biol 2011;13:506-12.
• Liu L, Rando TA. Manifestations and mechanisms of stem cell aging. J Cell Biol 2011;193:257-66.
• Lo Celso C, Prowse DM, Watt FM. Transient activation of beta-catenin signalling in adult mouse epidermis is sufficient to induce new hair follicles but continuous activation is required to maintain hair follicle tumours. Development 2004;131:1787-99.
• Lowry WE, Blanpain C, Nowak JA, et al. Defining the impact of      beta-catenin/Tcf transactivation on epithelial stem cells. Genes Dev 2005;19:1596-611.
• Moore KA, Lemischka IR. Stem cells and their niches. Science 2006;311(5769):1880-5.
• Nishimura EK, Granter SR, Fisher DE. Mechanisms of hair graying: incomplete melanocyte stem cell maintenance in the niche. Science 2005;307:720–724.
• Paus R, Foitzik K. In search of the “hair cycle clock”: a guided tour. Differentiation 2004;72:489-511.
• Plikus MV, Chuong CM. Complex Hair Cycle Domain Patterns and Regenerative Hair Waves in Living Rodents. J Invest Dermatol 2008;128 :1071-80.
• Plikus MV, Mayer JA, de la Cruz D, et al. Cyclic dermal BMP signalling regulates stem cell activation during hair regeneration. Nature 2008;451:340-4.
• Plikus MV, Widelitz RB, Maxson R, Chuong CM. Analyses of regenerative wave patterns in adult hair follicle populations reveal macro-environmental regulation of stem cell activity. Int J Dev Biol 2009;53:857-68.
• Plikus MV, Baker RE, Chen CC, et al. Self-organizing and stochastic behaviors during the regeneration of hair stem cells. Science 2011;332:586-89.
• Reddy S, Andl T, Bagasra A, et al. Characterization of Wnt gene expression in developing and postnatal hair follicles and identification of Wnt5a as a target of Sonic hedgehog in hair follicle morphogenesis. Mech Dev 2001;107:69-82.
• Tiede S, Kloepper JE, Bodò E, et al. Hair follicle stem cells: walking the maze. Eur J Cell Biol 2007;86:355-76.